本发明公开了一种磷霉素氨丁三醇杂质D的制备方法，属于医药技术领域，其技术要点包括如下操作步骤：步骤一、将磷霉素氨丁三醇溶于溶剂一，加热进行降解反应；液相监控反应程度，反应完成后加入溶剂二溶解并稀释得到20ml的液相，摇匀得到杂质D粗品；步骤二、将杂质D粗品中进行冻干，得到磷霉素氨丁三醇杂质D。本发明不仅操作步骤简单方便，而且反应流程短，反应条件温和，生产安全性能高。