本发明公开了一种从发酵液中提取纯化多杀霉素的方法，包括，往多杀霉素发酵液中加入碱调pH大于8，沉淀后固液分离，得滤渣；将滤渣溶于水中，加入酸调pH小于5，过滤后浓缩，得浓缩液；往浓缩液中加入有机溶剂进行萃取处理，收集有机层后加入活性炭脱色，得萃取脱色液；往萃取脱色液中加入酸液进行反萃取处理，收集水层后加入活性炭脱色，得反萃脱色液；往反萃脱色液中加碱结晶，分离得到多杀霉素粗品。本发明的方法综合采用板框过滤、陶瓷膜过滤、萃取、洗涤、脱色、反萃取、脱色和结晶技术，工艺周期短，不加热，溶剂使用少，去除杂质效率高，工艺操作简便，成本低廉，适合工业化生产多杀菌素。