本发明提供了一种采用高效液相色谱法分离测定琥珀酸曲格列及其汀光学异构体的方法，包括以三(S)‑α‑甲基苯基氨基甲酸酯直链淀粉为填料的色谱柱，和以正己烷‑低级醇溶液为流动相，其中，正己烷与低级醇的体积比为25 : 75~75 : 25，分离测定琥珀酸曲格列汀及其手性异构体的含量。采用该方法可以很好的将琥珀酸曲格列汀与其对映异构体进行有效分离和测定。该本法用于琥珀酸曲格列汀的质量控制，专属性强，准确度高，操作简便。