本发明公开了一种反相液相色谱法检测雷替曲塞对映异构体的方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以体积百分含量为40‑44％的甲醇水溶液为流动相，且1L该流动相中添加4‑6mL的三乙醇胺作为手性拆分试剂。本发明提供的方法可有效将雷替曲塞和其对映异构体分离，分离度大于1.5。本发明方法基于反相液相色谱，成熟通用，不存在现有技术中正相液相色谱和毛细管电泳的缺陷。