本发明提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA，包括用于敲除Dys基因43号内含子的gRNA和用于敲除Dys基因54号内含子的gRNA。本发明还提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良的gRNA、表达载体、CRISPR‑Cas9系统，以及它们的用途。与现有技术相比，本发明可以覆盖不少于60％的DMD患者；利用CRISPR‑SaCas9系统，有利于使用AAV病毒作为治疗载体，更具有针对性，安全性高更高；本发明筛选出来的gRNA，具有较高的打靶效率，从而对Dys基因读码框的纠正效率更高。