本发明提供了一种高含量12α‑羟基类固醇脱氢酶发酵液的发酵方法，属于生物与医药技术领域，取备用的12α‑羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌为菌种按体积份数为2‑6％的接种量接种到新型无菌发酵培养基中进行培养，2h后流加诱导培养基，共计流加8h。该发酵方法是在含12α‑羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌为菌种发酵生产12α‑羟基类固醇脱氢酶(12α‑HSDH)的过程中，以高营养低成本的新型培养基替代传统的LB培养基以及采用过程流加诱导培养基，通过培养，使培养菌菌体密度OD(600)达到50～60，同时12α‑羟基类固醇脱氢酶的酶活达到700～900U/L。