本发明属于生物发酵技术领域，公开一种从发酵液中分离提取维生素B12的方法，包括以下步骤：1)将维生素B12发酵液在避光条件下水解，过滤；2)采用机械法将菌体富集液中菌体细胞壁破除，加入絮凝剂，调pH至7.0～7.5，过滤；3)将滤液混合后，经大孔树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第一解析液，将吸附后的滤液调节pH至4.0～5.0，加热处理后，过滤，然后经大孔树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第二解析液；4)解析液经苯乙烯类改性层析树脂柱吸附、展层和解吸，得到纯化液；5)纯化液经浓缩、干燥，得到维生素B12。通过对发酵液的预处理及分离步骤的合理设置，能充分提取维生素B12，提高维生素B12的收率。