本发明提供联合免疫基因抑制HBV复制的特异性sgRNA、表达载体及其应用：具体包括设计适合CRISPR‑Cas9靶向剪辑的人乙型肝炎病毒基因和PD‑1基因的sgRNA序列，构建抑制HBV和PD‑1基因sgRNA，将其与核酸酶基因的表达载体联合转入HBV转基因小鼠体内可以明显抑制HBV DNA的复制。本发明制备的基因表达载体方法步骤简单、sgRNA靶向性好、CRISPR‑Cas9系统的敲除效率高。因此，这些特异性靶向HBV和PD‑1基因的sgRNA可以精确剪接HBV和PD‑1基因，发挥抑制体内乙型肝炎病毒复制，降低乙肝病毒抗原表达的作用。