本发明涉及Rv3121蛋白在检测结核分枝杆菌感染中的应用，所述抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的蛋白抗原的制备方法包括如下步骤：步骤(1)以催化Rv3121的入门载体(美国Craig Ventor Institute下设的PFGRC所免费提供)和载体重组生成Rv3121的表达载体；步骤(2)将步骤(1)所述Rv3121的表达载体转化目标表达宿主，表达目标Rv3121蛋白；步骤(3)破碎细胞收集蛋白包涵体并复性目标蛋白。