本发明公开了一种纳米抗菌纤维的制备方法及其应用。该方法包括以下步骤：(1)细菌纤维素初始分散液的制备：将细菌纤维素放入纳米磨浆机中进行磨浆，得到细菌纤维素初始分散液；(2)氧化细菌纤维素的制备：向细菌纤维素初始分散液中加入氧化剂，遮光进行反应，待反应结束后，离心，洗涤，得到氧化细菌纤维素；(3)将氧化细菌纤维素加入到壳聚糖溶液中，在40～80℃条件下搅拌反应，洗涤，离心，超声粉碎，得到纳米抗菌纤维。本发明是将壳聚糖通过席夫碱反应接枝到细菌纤维素上，两者之间结合强度好，获得的抗菌纤维可以达到纳米级别，同时兼具有纳米材料的优势和抗菌性能，可应用于抗菌衣服、医药卫生以及包装等领域。