本发明提供一种微量DNA的定量方法，至少包括以下步骤：设计内标模板；设计能够同时扩增目标模板和内标模板的引物对；利用所述引物对，将待测DNA序列和内标模板混合后进行PCR扩增；将扩增产物用二代测序平台对应的接头引物对进行再次扩增，获得二代测序文库；对所述二代测序文库进行二代测序平台测序；根据公式待测DNA的拷贝数=C*A1/A2，计算得目标模板的拷贝数，即为待测DNA的拷贝数；其中，C为内标模板的拷贝数；A1为目标模板序列的测序覆盖深度；A2为内标模板序列的测序覆盖深度。本发明不仅可以准确定量微量DNA，还可以直接读取目标DNA模板的序列，定量结果准确性不受非特异性扩增的影响。