本发明公开了一种生产乙酰丙酮的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域，所述重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，将编码乙酰丙酮裂解酶的基因、甲基乙二醛合成酶的基因、磷酸丙糖异构酶的基因导入到大肠杆菌，得到重组菌，首次实现了乙酰丙酮的生物合成。本发明所构建的重组菌可以利用葡萄糖为唯一碳源合成乙酰丙酮，发酵48h，可以得到53mg/L的乙酰丙酮。