本申请公开一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法及应用，该方法为尿苷二磷酸4‑位巯基2‑位酰胺基葡萄糖或尿苷二磷酸4‑位巯基2‑位酰胺基半乳糖糖基供体类化合物酶催化构建含硫苷键糖胺聚糖式(XIV)的方法。糖胺聚糖在抗肿瘤转移方便具有广阔的前景，但存在半衰期短的缺点。本发明涉及硫代糖苷键糖胺聚糖的合成，由于硫苷键相比氧代糖苷键在代谢过程中更加稳定，因此本方法可用于药代动力学性质更好的抗肿瘤药物的制备。