本发明公开了一种慢病毒载体制备用293T细胞培养基，它以DMEM培养基作为基础液，添加胎牛血清、GlutaMax‑Ⅰ、非必需氨基酸、丙酮酸钠、D‑(+)‑半乳糖、Hepes制成。本发明还公开了该细胞培养基的制备方法，包括步骤：1)将D‑(+)‑半乳糖加入DMEM培养基；2)D‑(+)‑半乳糖溶解完再依次加入胎牛血清、丙酮酸钠、非必需氨基酸、Hepes及GlutaMax‑Ⅰ，混合溶解；3)将步骤2)中配制的混合液补加DMEM培养基定容至1L；4)过滤得到无菌的293T细胞培养基。本发明培养基相较于传统培养基更有利于实现细胞的稳定增殖，提高病毒的包装效率，病毒滴度高，纯度好，适用于商业化批量生产。