本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌同时基因敲除及基因表达抑制的双功能系统及应用。本发明构建的CRISPR/Cas12a系统的载体，包括Cas12a蛋白基因和crRNA的编码DNA。本发明构建的CRISPR/Cas12a基因载体能够对谷氨酸棒杆菌基因组同时进行基因敲除和基因表达抑制，具有实验周期短、节省时间和效率高等优点。