本发明涉及以蓝光激活的blebbistatin类似物杀灭耐药细菌的应用及方法，其中blebbistatin类似物包括(R)‑blebbistatin；所述耐药细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌；所述蓝光波长为420nm。本发明将没有哺乳动物靶标、没有生物活性的(R)‑blebbistatin通过波长为420nm的蓝光激活后用于杀灭耐药细菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌，具有显著的杀菌效果。本发明还发现活体中采用(R)‑blebbistatin分子进行60min处理是安全的；且随着光照时间增加杀菌效率提高，不存在诱导耐药风险的出现。本发明不受细菌耐药性限制，为临床多重耐药性细菌的治疗提供坚实有力的技术支撑。